近 100 年前，一项看似简单的发现彻底改变了光学显微镜。相差（phase contrast）技术的引入（该技术于 1953 年获得诺贝尔奖）使生物学家得以清晰观察到细胞内那些此前过于微弱或模糊不清的结构。

如今，加州大学伯克利分校的物理学家将相差技术应用到了电子显微镜上——后者的放大倍数约为光学显微镜的 10,000 倍。这项研究成果发表在《科学》（Science）杂志上。

增加一种被称为激光相位板的装置，有望极大改善冷冻电子显微镜（cryo-EM）——一种解析分子结构的技术。十年前，冷冻电镜本身已经彻底改变了人们对蛋白质的理解，并加速了新药发现。

然而，尽管影响巨大，冷冻电镜至今仍难以清晰成像小分子——包括大多数人类蛋白质。激光相位板有望清晰成像细胞中绝大多数小至现有机器难以处理体积三分之一的蛋白质。

激光相位板的加入似乎也必将彻底改变一项较新的技术——冷冻电子断层扫描（cryo-ET）。该技术通过组合一个分子或蛋白质的不同角度视图，重建出三维图像。这使得分析蛋白质在其天然环境（细胞内部）而非溶液中成为可能。

“冷冻电镜已成为解析生物大分子结构的最快速发展的新方法，而冷冻电子断层扫描预计将揭示这些分子在其天然细胞环境中如何协同工作。”领导这项技术开发的加州大学伯克利分校物理学教授、劳伦斯伯克利国家实验室教员科学家Holger Müller说。

“但由于信噪比的限制，大多数人类和动物蛋白质太小，无法通过这些方法分析。激光相位板提供的信噪比提升有望克服这些重要限制。”

这一发展的关键是最强、最聚焦的连续波激光器。该激光器与电子束相互作用，改变其相位。这种相位变化增强了小分子（如血红蛋白）以及细胞内分子和结构（如细胞核和线粒体）的衬度。

“使用冷冻电子断层扫描时，我们观察的是细胞内极其拥挤的微小、复杂的细胞物质。”加州红木城 Biohub 的成像技术创始总监Bridget Carragher说。

“这就像一片森林，你想在其中找到一棵树的一片叶子。冷冻电子断层扫描需要衬度的大幅飞跃，这样我们才能看到细胞内部发生的情况。这正是激光相位板承诺给予我们的。”

Müller购买了一台最先进的冷冻电镜，随后为其配备了激光相位板，创造出一台他称之为Theia的显微镜（以古希腊光芒与辉光女神提亚命名）。

Carragher正在 Biohub 位于红木城的成像实验室监督类似设备的开发——该设备采用双激光系统，基于Müller及其同事发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上的理论工作（Nature Communications, 2026, doi:10.1038/s41467-026-74060-6）。在该系统中，两束垂直的激光束以约一半功率运行，降低了组件的烧毁风险并减少了像差。

两个团队均与冷冻电镜设备的主要制造商Thermo Fisher Scientific合作。

“Theia 是显微镜中的一级方程式赛车。”Müller说。“它拥有额外的电子光学元件，即使在无激光的情况下，分辨率也优于标准冷冻电镜。加上激光相位板后，我们希望它真正成为全世界最优秀的仪器。”

Müller 及其伯克利团队在 6 月 11 日的《Science》杂志上发布他们最新的图像和冷冻电镜激光相位板的详细信息。Biohub 的双激光系统已在最近发布的预印本中进行了描述(bioRxiv, 2026, doi:10.64898/2026.06.05.730245)。

生物成像

动植物细胞主要由水组成，在光学显微镜下是透明的，这理应使细胞核和线粒体等内部结构易于观察。但这些结构很小，只能散射少量光，因此仅比细胞内部其他部分稍暗。这种低衬度通常通过染色来改善，但染色也会杀死细胞。

1930 年，荷兰科学家Frits Zernike意识到，光穿过细胞时，不仅亮度（振幅）会改变。散射光在生物样本中也会减慢速度，从而导致其相位（波形峰值的时间点）发生微小偏移。

虽然这种相移对人眼不可见，但通过将非散射光的相位也偏移 90 度，可以将其转化为可见的衬度。当散射光和非散射光最终聚焦在视网膜上时，样本中的特征相对于背景得到增强，从而提高了衬度。Zernike因这一发现获得了 1953 年诺贝尔物理学奖。

到 1940 年代初，相差显微镜已证明了其价值，科学家们开始设想将这一技术应用于电子显微镜，以增加衬度。电子显微镜使用电子束对更小的结构（如蛋白质）进行成像。但制造能改变电子束相位的相位板的尝试，要么使电子束强度下降过多，要么导致图像不稳定，要么分辨率降低。

2010 年，Müller和现为伯克利分子与细胞生物学名誉教授的Robert Glaeser撰写了一篇论文，提出利用强激光产生相移，这种方法不会减弱电子束。

Glaeser是冷冻电镜的先驱之一。冷冻电镜是电子显微镜的一次重大改进，理论上比 X 射线晶体学更简单地解析分子结构——后者要求分子实际形成晶体，且研究人员必须能获得明亮的 X 射线源。

但电子显微镜的一个主要问题是电子束会加热并最终损坏其靶标，限制了图像细节。为防止这种情况并增强衬度而在样品上镀金属，只会使图像更模糊。

在 1960 年代，科学家提出冷冻样品以减缓样品破坏。Glaeser证明冷冻样品可减少辐射损伤，并提议通过降低电子束功率同时辐照数千个冷冻分子来进一步减少损伤。尽管样品中的每个分子朝向随机，但计算机可以将所有图像组合起来创建出高分辨率的分子结构。

冷冻电镜的奠基人被授予 2017 年诺贝尔化学奖，并在获奖感言中致谢Glaeser的工作。据诺贝尔委员会称，冷冻电镜“既简化又改进了生物分子的成像。该方法已将生物化学带入了一个新时代。”

2010 年论文发表后，Müller花了 15 年时间实现了冷冻电镜激光相位板的目标。首先，他和团队必须开发一种方法，将连续激光聚焦到一个微小光斑上，以产生足够强的光，使电子束的相位偏移 90 度。

经过 10 年，他们通过将激光束困在一个球形镜面腔体内实现了这一目标。该腔体同时聚焦光束，并在光线来回反弹超过 10,000 次时增强其强度。

“那是 75 千瓦的功率聚焦在几微米上。”Müller说。“这比焊接用的功率还大。比军用激光还强。它形成了有史以来最亮的连续激光聚焦。”

他们通过将激光相位板安装到Glaeser的一台旧显微镜中证明了该概念的可行性，但后续资金允许他们购买了一台定制的、最先进的 Thermo Fisher Krios 冷冻电镜并进行改装。在新论文中，他们展示了这种强聚焦激光束对六种不同大小和不同样品制备方式的样本产生了更高分辨率的图像。

“对于最具挑战性的情况——小颗粒、质量差的样本，激光带来了非常显著的优势。”Müller说。

在他们的论文中，他们展示了肌肉来源的醛缩酶蛋白（使用现有冷冻电镜相对容易成像）和血红蛋白（血液中携带氧气的蛋白，处于现有机器的成像极限下限）的重建图像。激光相位板在两种情况下均提高了蛋白质结构的分辨率，但对更小的血红蛋白分子提升更明显。

“底线是：如果你有一个大的蛋白质和一个非常好的样本（例如新鲜样本或冷冻时没有气泡的样本），你可能不需要相位板就能获得单张高质量图像。但对于小蛋白质和质量差的样本，开启激光是最佳选择。”Müller说。

“这有望填补我们对那些无法结晶或对于当今冷冻电镜而言太小的蛋白质结构的知识空白。而且它将对冷冻电子断层扫描产生革命性影响。”

蛋白质大小以道尔顿（dalton）为单位——以英国化学家John Dalton命名，相当于一个碳-12 原子质量的 1/12。目前冷冻电镜几乎无法对小于 70 千道尔顿（kDa）的蛋白质成像，而这类蛋白质约占人类蛋白质组的 90%。有了激光相位板，现在可以（尽管仍有难度）成像小至 50 kDa（甚至比血红蛋白还小）的蛋白质。

Müller希望不久能将这一极限推进到 17 kDa（肌红蛋白的大小）。他对此持乐观态度，认为这可以通过使用聚焦电子束来实现——而目前在没有激光相位板的情况下，为获得任何衬度必须使用散焦电子束。这一优势将是激光相位板的另一个好处，在已有增益的基础上，再为衬度和信噪比带来一倍的提升。他说，激光相位板应该能够仅从聚焦电子束的相位变化中提取衬度。

“这项技术是生物学的一次阶梯函数式的改变。”Biohub 成像科学副总裁Stephani Otte说。“我们第一次能够亲眼看到分子机器在活细胞内部如何运作，在它们所处的环境中运行。曾经不可见的东西将变得可见——这将彻底改变我们理解疾病的方式。”（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Petar N. Petrov et al, Laser phase plate improves structure determination of small proteins by cryo-EM, Science (2026). DOI: 10.1126/science.aeh0665.