簇状同源异形盒（HOX）基因编码高度保守的转录因子，对胚胎发育至关重要，尤其是在建立体轴模式和确定体节身份方面。其中，HOXA位点最初被发现是体节分节的调节因子，但最近已被确定为正常和恶性造血的关键调节因子。例如，HOXA基因控制着人和小鼠造血干细胞（HSC）的特化、自我更新和维持。此外，几个HOXA基因（尤其是HOXA9）常因体细胞驱动事件的激活而在急性髓系白血病（AML）中过表达，并预示预后不良。尽管这些观察结果强调了在造血过程中严格调控HOXA位点的重要性，但其完整的潜在调控机制仍有待阐明。

目前已在HSC中鉴定出几个HOXA位点基因表达的调控因子。例如，SOX17已被证明可在发育中的生血内皮中调节HOXA基因表达，以启动确定性造血。此外，混合谱系白血病（MLL）融合蛋白的直接结合可促进白血病中HOXA基因的异常表达，之前的研究也证明了HSC中HOXA位点转录延伸增加在驱动遗传性髓系恶性肿瘤易感性中的作用。此外，三维染色质相互作用可以维持长距离增强子-启动子相互作用。已证明HOXA7和HOXA9之间的CCCTC结合因子（CTCF）边界的破坏会改变染色质拓扑结构，并在AML中异常激活后部HOXA基因的表达，这凸显了基因组结构在调节HOXA位点中的关键作用。

长链非编码RNA（lncRNA）也已被证明在HOXA基因调控的多个方面发挥着关键作用。在胚胎干细胞分化过程中，lncRNA Haunt 及其所在的基因组位点已被证明对HOXA基因激活具有相反的作用，突显了该位点顺式调控的复杂性。重要的是，HOXA簇内的反义lncRNA对HOXA基因表达具有直接的调控作用。例如，lncRNA HOTTIP 促进HOXA基因上的染色质活化和成环，其过表达增强HSC自我更新，促进AML的发病机制。位于 HOXA1和HOXA2之间的HOTAIRM1在髓系分化过程中调节HOXA1和HOXA4 的表达（部分通过剪接调控），同时还塑造染色质状态和三维结构以协调HOXA基因的激活。尽管这些观察结果表明lncRNA和其他调节因子在该位点转录调控中起着关键作用，但人类遗传变异对HOXA基因表达的影响仍鲜为人知。

在一项新的研究中，在研究HOXA位点与血液表型相关的变异时，研究人员偶然发现该位点 HOXA7和HOXA9之间反义方向上存在一个此前研究甚少的lncRNA，它在HSC自我更新中起着关键作用，他们将其命名为HOTSCRAMBL（全称为 HOXA opposite-strand transcript, stem-cell regulator, antisense mid-cluster between loci）。重要的是，他们对 HOTSCRAMBL的研究揭示了进化上近期获得的、在发育过程中精细调控HOX基因表达的机制。

HOXA位点lncRNA中与造血功能改变相关的遗传变异

尽管已证明影响造血的遗传变异会间接改变HOXA 基因的表达，但该位点内遗传变异对造血的影响此前尚未被研究。因此，他们对与该位点造血表型相关的生殖系变异进行了全面评估。通过分析，他们鉴定了五个独立单倍型中的常见变异，这些变异与各种血细胞计数表型相关（图1A）。其中，前哨变异rs35355140与一系列测得的血细胞计数（涵盖白细胞及其各种亚型、血小板和红细胞，即所有主要造血谱系）的全面减少相关。此外，该变异还与可能受HOXA基因表达影响的人体测量学表型（如坐高和踝间距减小）相关。重要的是，该单倍型进一步与白细胞端粒长度缩短相关（图1B），表明它与HSC自我更新能力下降有关。此外，他们观察到骨髓增殖性肿瘤（一种慢性血癌）风险降低（比值比[OR] = 0.89，95%置信区间[CI] = 0.82–0.95，p = 0.001），纳入 JAK2 突变体克隆造血后效果更显著，同时Y染色体丢失（LOY）（一种癌前状态）的风险也降低（OR = 0.84，95% CI = 0.81–0.87，p = 7 × 10⁻²¹）。他们未观察到与其他克隆性造血表型的关联，尽管在某些情况下检测关联的总体效能可能有限（图1C）。这些观察结果表明，该单倍型可能调节原始HSC区室中HOXA簇的功能，从而抵抗HSC的年龄相关转化。

图1 血细胞表型的GWAS鉴定出位于HOTSCRAMBL（一个在人HSC中高度富集的lncRNA）内的rs17437411

他们进行了精细定位（图1D），确定rs17437411是该单倍型中唯一可能的功能性变异。预测rs17437411可能改变一个位于 HOXA7和HOXA9 之间的、长度为633 bp且缺乏开放阅读框的基因间lncRNA（ENST00000602610）的剪接或其他活性。ENST00000602610此前研究甚少，他们在此将其命名为 HOTSCRAMBL。

值得注意的是，HOTSCRAMBL的基因组DNA序列在哺乳动物中高度保守（例如，与猴相似度为94.5%，与小鼠为71.2%），但在非哺乳类脊椎动物（如非洲爪蟾和斑马鱼）中序列相似性低。相比之下，邻近的HOXA基因（如HOXA9）在其DNA编码序列区域表现出强的跨物种保守性（例如，与猴相似度为97.9%，与小鼠为93.1%，与非洲爪蟾为70.7%，与斑马鱼为59.2%）。此外，在其他物种中未鉴定出该人类lncRNA的同源物。

HOTSCRAMBL在造血系统内的表达主要限于CD34⁺ 造血干/祖细胞（HSPC），尤其是最原始的HSC中（图1E–1G）。确实，尽管在 bulk CD34⁺ HSPC中HOTSCRAMBL阳性细胞很少，但在CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSC富集群体中检测到更高的HOTSCRAMBL表达。亚细胞分离显示HOTSCRAMBL 主要定位于细胞核。与此一致，使用两个独立反义探针进行的RNA荧光原位杂交（FISH）在CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSPC的细胞核内和核周检测到清晰的 HOTSCRAMBL 信号。此外，使用靶向 HOTSCRAMBL的独立读出探针组进行的多重容错荧光原位杂交（MERFISH）显示了相似的空间分布模式，在细胞核内和近核周检测到离散的点状信号（图1H和图1I）。尽管该位点内的其他lncRNA（如HOTTIP和HOTAIR）已被证明在调控HOXA簇中起重要作用，但HOTSCRAMBL的功能尚未被阐明。受该lncRNA内变异与造血关联观察结果的启发，他们推测对该变异和HOTSCRAMBL的进一步研究可能提供新的功能见解。

HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 降低体外LT-HSC维持能力

他们试图直接探究HOTSCRAMBL及其相关的rs17437411变异在原代人CD34⁺ HSPC中的作用（图2A）。为此，他们开发了一种高保真CRISPR-Cas9编辑方法，以模拟HOTSCRAMBL敲除（KO）（删除HOTSCRAMBL，不直接影响其他HOXA基因或调控元件）的效果，实现了约80%的删除效率，并使 HOTSCRAMBL 表达下调约68%。他们还通过胞嘧啶碱基编辑器（CBE）在原代人CD34⁺ HSPC中精确模拟了精确的rs17437411 C>T变异，未对邻近碱基引入任何非预期的改变。他们在 HOTSCRAMBL 中实现了约75%等位基因的编辑，且不影响 HOTSCRAMBL 的表达。这些编辑分别以AAVS1安全港位点的Cas9或CBE介导的编辑作为基准对照。

图2HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 通过促进体外增殖和分化损害人LT-HSC的维持

鉴于HOTSCRAMBL在HSC中选择性表达，他们试图评估其在这些细胞区室中的作用。尽管HOTSCRAMBLKO在体外培养的人CD34⁺ HSPC中轻度降低了表型长期重建（LT）-HSC（CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺CD133⁺EPCR⁺ITGA3⁺）的维持（图2B和图2D），但HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑导致LT-HSC更显著地减少（图2C和图2E）。为揭示HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后HSC群体如何丧失，他们进行了凋亡和细胞周期分析。尽管未检测到凋亡增加，但 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑使处于S/G2/M期的CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSPC比例增加了2.5倍（图2F），且在编辑后72小时，其细胞分裂次数比AAVS1 CBE组多3-4倍（图2G和图2H）。这些观察结果表明，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 降低了原始HSC的维持和静止状态，这可能促进了这些细胞的分化，正如他们之前在其他干预中观察到的那样。

与此一致，当富集表型LT-HSC时，他们发现HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 降低了经典HSC标志物基因（包括HLF,MECOM,CRHBP和MLLT3）的表达。此外，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的HSPC显示多能集落形成单位-粒系、红系、巨噬系和巨核系（CFU-GEMM）集落丧失7倍，而更分化的爆增式红系集落形成单位（BFU-E）集落则反向增加了1.5倍（图2I）。总之，这些发现表明rs17437411在体外可减少HSC维持并促进这些细胞的分化。

HOTSCRAMBL功能丧失促进分化并减少HSC自我更新

为更严格地评估HOTSCRAMBL如何调节人HSC功能，他们将编辑过的人CD34⁺ HSPC异种移植到Kit突变且免疫缺陷的NOD.Cg-Kitʷ⁻⁴¹ᴶᵀʸʳ⁺PrkdcˢᶜⁱᵈIl2rgᵗᵐ¹ʷʲˡ/ThomJ（NBSGW）小鼠中（图3A）。有趣的是，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞在移植后第4周最初显示出3.8倍更高的外周嵌合率，但在16周达到长期植入后，嵌合率降低了3倍（图3B）。HOTSCRAMBLKO在移植后16周也显示出1.3倍的植入减少（图3B）。

此外，尽管在骨髓CD34⁺ HSPC中HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 或KO编辑被负向选择（图3C），表明HOTSCRAMBL缺失导致竞争劣势，但编辑频率在移植后的CD34阴性细胞中反向增加（图3D）。此外，HOTSCRAMBL 破坏导致骨髓中早期红系祖细胞（CD71⁺CD235a⁻）的定向分化增加。总之，这些数据与体内HSC中 HOTSCRAMBL受干扰或缺失后自我更新失败和分化倾向增加相一致。

图3HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 损害人HSC的长期植入并在体内促进分化

他们接下来评估了HOTSCRAMBL 如何调节造血的多谱系重建。一旦实现长期植入，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞在骨髓（减少1.6倍）和脾脏（减少1.9倍）中均显示出人嵌合率的显著降低（图3E和图3F），而HOTSCRAMBLKO的总人嵌合率无显著降低。在植入的人细胞中，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑降低了CD34⁺ HSPC和CD19⁺ B细胞的比例，但增加了CD15⁺ 粒细胞和单核细胞的比例。尽管如此，HOTSCRAMBLKO和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑均降低了所有谱系的绝对数量（图3G和图3H）。此外，来自骨髓的HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的CD34⁺ 细胞在二次铺板集落时，原始CFU-粒/巨噬细胞（CFU-G/M）和CFU-GEMM集落的数量和大小均减少（图3I、3J）。重要的是，随着连续铺板，集落形成潜力逐渐丧失，表明 HOTSCRAMBL编辑降低了HSC的自我更新。总之，这些数据支持rs17437411损害人HSC的自我更新并促进其分化的观点，而删除HOTSCRAMBL具有相似但较温和的影响。

rs17437411对人HSC的影响依赖于HOTSCRAMBL转录本

尽管rs17437411编辑在体外和体内诱导了人HSC的丧失，并且删除HOTSCRAMBL本身产生了较温和的表型，但他们试图验证其效应是否依赖于lncRNA活性（图4A）。用两种独立的反义锁核酸（LNA）GapmeR（设计用于特异性降解HOTSCRAMBL和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹）靶向HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞（第2天）。该策略在CD34⁺ HSPC中实现了对野生型和 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑转录本超过50%的敲低。引人注目的是，敲低挽救了 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后的HSC损失（图4B），并且虽然部分恢复了集落形成潜力（图4C），但对对照组影响极小，类似于HOTSCRAMBLKO观察到的较温和影响。

图4HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 以转录本依赖的方式调节LT-HSC维持

他们接下来测试了表达HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ RNA是否足以降低HSC维持。在HOTSCRAMBL KO后，他们使用SnoVector在细胞核中外源表达 HOTSCRAMBL（图4D）。外源表达的 HOTSCRAMBL RNA主要定位于细胞核，且表达水平比对照组高约4.5倍。在 HOTSCRAMBLKO后，外源表达HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 转录本表型复制了通过内源基因组编辑引入rs17437411所观察到的效应，导致LT-HSC维持的丧失（图4E）和集落铺板潜力的丧失（图4F）。值得注意的是，表达突变型lncRNA可以损害表达野生型HOTSCRAMBL的LT-HSC的维持，这表明HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 可能具有显性失活或新形态活性。

HOTSCRAMBL调节人HSC中HOXA9的表达

在确定HOTSCRAMBL为人HSC的新型调节因子后，他们试图了解其潜在机制。在HOTSCRAMBLKO或HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后，对CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSC富集细胞进行了RNA测序（RNA-seq）（图5A）。尽管HOTSCRAMBLKO细胞仅表现出轻微的转录变化，但HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 变异编辑导致几个基因集显著下调，包括HSC特征基因，同时细胞周期相关基因上调，与实验观察一致（图5B）。值得注意的是，在 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 或KO组中，许多HOXA基因（特别是HOXA6,HOXA7和HOXA9）以及来自该位点的两个反义非编码RNA HOXA-AS2 和 HOXA-AS3均显著下调（图5B和图5C）。通过更全面地分析观察到的基因表达变化，他们发现尽管全基因组范围内的剪接事件结果在所有组中相似，但 HOTSCRAMBL的KO或突变特异性地改变了几个HOXA基因的剪接和/或表达，其中高表达的HOXA9 mRNA改变最为显著。这很有趣，因为有研究发现在其靶基因附近转录的lncRNA可以通过与染色质或剪接机制的直接相互作用调节共转录剪接。这在HOXA位点尤其有意义，因为高水平转录延伸对于改变HSC和其他干细胞群体中这些基因的表达至关重要。

图5 剪接效率降低是HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后HOXA9 表达受损的基础

在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后，HOXA9是差异剪接最显著的基因之一，变化幅度尤其突出。HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑损害了HOXA9外显子1和外显子2之间内含子接头的生产性剪接（图5D和图5E），并导致HOXA9mRNA水平降低（图5F），这与该变化是HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 直接效应的结果一致。重要的是，他们验证了HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑进一步降低了CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSC富集细胞中HOXA9蛋白的表达（图5G），并重现了HOXA9 敲低特征。总之，这些数据表明 HOTSCRAMBL可能调节该位点HOXA9及其他基因的表达。这很值得注意，因为HOXA9在人HSC中高度富集，是已知的原始HSC状态的强效调节因子，且其过表达与AML中极差的预后相关。

他们接下来验证了HOXA基因（尤其是受HOTSCRAMBL干扰影响的HOXA6,HOXA7和HOXA9）的改变如何影响人HSC。他们使用靶向HOXA6,HOXA7和HOXA9 的引导RNA进行了基因敲除实验。所有引导RNA均显示出约80%的编辑效率。有趣的是，他们发现 HOXA9干扰在体外降低了LT-HSC的维持，而单独干扰HOXA6或HOXA7 则没有（图5H），这表明 HOXA9水平降低可能主要导致了HOTSCRAMBL编辑后观察到的HSC丧失。为进一步证实差异HOXA9剪接的功能性，他们进行了HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑，并试图通过慢病毒表达HOXA9前体mRNA（含内含子）或剪接后的mRNA来挽救HSC的损失（图5I）。重要的是，只有表达剪接后的HOXA9mRNA才足以部分挽救LT-HSC的损失（图5J），证明HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 通过降低HOXA9剪接和表达在功能上调节人HSC。

HOTSCRAMBL协调SRSF2依赖性的HOXA9剪接

他们接下来想知道rs17437411和HOTSCRAMBL的缺失如何在功能上损害HOXA9的剪接。基于计算机模拟，他们首先预测rs17437411变异可能改变HOTSCRAMBL的二级结构，该模拟显示了野生型HOTSCRAMBL和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 序列之间的局部构象差异。为了实验验证这一点，他们对体外转录的HOTSCRAMBL和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ RNA进行了硫酸二甲酯突变谱分析结合测序（DMS-MaPseq）。他们发现 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 采纳了一种野生型HOTSCRAMBL中不存在的替代结构。野生型HOTSCRAMBL主要采纳单一稳定构象，而HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 产生两种替代结构状态（α 和 β），其分数占比分别为0.56和0.44。DMS信号的滚动相关性和结构模型显示，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹-α 构象与野生型相比差异较小，而HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹-β 构象则表现出显著的结构重排。这些数据表明rs17437411显著改变了 HOTSCRAMBL的结构平衡，这可能进而影响其RNA-RNA或RNA-蛋白质相互作用，从而干扰下游功能。

为了解HOTSCRAMBL改变HOXA9剪接的直接机制，他们试图鉴定HOTSCRAMBL的结合靶点（图6A）。他们在两个AML细胞系（MOLM13和OCI-AML4）中进行了这些分析，这些细胞系在RNA和蛋白质水平上均表现出与人类CD34⁺ HSPC相当的强HOTSCRAMBL和HOXA9 表达。在 HOTSCRAMBLKO或HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后，用几个生物素化探针靶向 HOTSCRAMBL 转录本并进行pull-down，通过RNA纯化染色质分离（ChIRP）结合测序（ChIRP-seq）鉴定结合的mRNA。HOTSCRAMBL KO消除了RNA pull-down，验证了他们的方法，而 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 改变了对特定转录本（包括HOXA9）的结合。HOTSCRAMBL显示出与HOXA9的内含子及外显子-内含子边界区域富集结合（图6B），而rs17437411变异使HOTSCRAMBL在HOXA9基因体上的占有率降低了约2倍（图6C），在剪接的内含子上有明显的丢失，他们通过ChIRP-qPCR进一步验证了这一点（图6D）。

图6HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 通过削弱SRSF2介导的前体mRNA剪接损害HOXA9 表达

为了进一步确定潜在的机制，他们通过质谱（ChIRP-MS）进行了RNA结合蛋白的全面鉴定。有趣的是，在 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑组中，一组低于50 kDa的蛋白质显示出结合减少。此外，通过ChIRP-MS，在MOLM13和OCI-AML4细胞系中分别鉴定出41个和80个直接结合的蛋白质。引人注目的是，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑降低了HOTSCRAMBL与几个剪接因子（包括异质核核糖核蛋白（hnRNP）复合物的成员）的结合，并且根据定量肽段，与SRSF2的结合降低了约2倍（图6E和图6F）。鉴于DMS-MaPseq揭示了HOTSCRAMBL 中显著的结构重排，他们接下来探究这些构象变化是否会消除与SRSF2的相互作用。对预测的SRSF2结合基序处DMS反应性的检查显示，两个位点的可及性降低，其中一个位于核苷酸126附近的变异附近，另一个位于核苷酸308（图6G）。尽管在野生型和 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 结构中SRSF2结合位点仍然是暴露的，但DMS约束的替代构象结构模型表明这些基序变得部分遮蔽（图6H）。HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 替代形式中RNA结构的这种局部闭合可能是上述观察到的SRSF2结合丧失的基础。与此模型一致，RNA免疫沉淀（RIP）-qPCR显示SRSF2可以直接结合HOTSCRAMBL和HOXA9mRNA（图6I和图6J）。值得注意的是，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑足以消除约70%-80%的SRSF2与HOTSCRAMBL和HOXA9的结合（图6K和图6L），表明SRSF2与HOXA9mRNA或前体mRNA的有效相互作用依赖于HOTSCRAMBL。

为了进一步明确HOTSCRAMBL、HOXA9和SRSF2在原代CD34⁺ HSPC中的机制关系，他们在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 或对照编辑的细胞中进行了RNA FISH和免疫荧光联合分析。这些分析揭示了含有HOTSCRAMBL的点状信号与HOXA9前体mRNA和SRSF2核灶点均存在强共定位，而在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞中HOXA9 前体mRNA的表达显著降低。为了评估 HOTSCRAMBL和HOXA9前体mRNA的相对化学计量比，他们在对照AAVS1 CBE或HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的MOLM13细胞中通过qPCR进行了绝对定量。尽管两组间HOTSCRAMBLRNA水平保持不变，但在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞中，每个细胞的HOXA9前体mRNA拷贝数显著降低，并且HOXA9前体mRNA与HOTSCRAMBL的比率在AAVS1 CBE样品中约为2.6，在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 样品中约为1.7，表明 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞中HOXA9表达选择性降低。为了测试剪接的直接需求，他们进行了微小基因剪接实验，其中在MOLM13细胞中表达最小的HOXA9外显子-内含子-外显子连接，并通过RT-PCR评估HOXA9的有效剪接（图6M）。HOTSCRAMBLKO和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑足以降低微小基因和内源HOXA9转录本的HOXA9剪接（图6N），验证了HOTSCRAMBL在促进该转录本有效剪接中的作用。引人注目的是，用引导RNA干扰SRSF2足以显著降低微小基因构建体和内源HOXA9 的剪接效率（图6O）。一致地，高分辨率RNA FISH进一步揭示了 HOTSCRAMBL与HOXA9前体mRNA的显著共定位，支持其在共转录剪接中的作用。

值得注意的是，这种共定位在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑的细胞中减少，强化了该变异引起的功能破坏（图6P和图6Q）。总之，这些数据表明HOTSCRAMBL有助于协调SRSF2定位到HOXA9以促进有效剪接。rs17437411变异可能通过改变HOTSCRAMBL二级结构来破坏这种相互作用，从而解偶联RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用，并减少HOXA9mRNA的产生（图6R）。

HOTSCRAMBL的遗传调控诱导人AML细胞分化

在人类AML中，HOXA9以及HOXA6,HOXA7 和非编码基因 HOXA-AS2, HOXA-AS3的高表达均与高危疾病和不良临床结局相关。基于他们的功能数据证明 HOTSCRAMBL在人HSC中调节HOXA9的有效剪接和其他HOXA基因的表达，他们探讨了HOTSCRAMBL表达在人AML中的相关性。他们观察到，在儿童和成人AML中，高的HOTSCRAMBL表达都预示着更差的预后（图7A）。

图7HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 损害HOXA9依赖性白血病细胞模型中的白血病细胞生长和集落形成

他们接下来研究了HOTSCRAMBL的表达或功能（rs17437411）改变可能会如何干扰依赖HOXA的AML。他们在多种人AML细胞系（MOLM13、OCI-AML4和MUTZ-3）中进行了遗传干扰，所有这些细胞系均显示出HOTSCRAMBL和HOXA9的强表达（图7B）。作为阴性对照，他们还在K562细胞中进行了编辑，该细胞仅有最低水平的内源HOTSCRAMBL和HOXA9表达。HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑降低了HOXA9 的表达（如在人HSC中观察到的那样），并使MOLM13和OCI-AML4细胞的生长减少约2倍，MUTZ-3细胞减少约1.5倍。尽管K562细胞在细胞周期进程中没有变化，但 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑显著降低了MOLM13和OCI-AML4细胞的增殖。相反，在MUTZ-3细胞（更类似于干细胞，含有高比例的CD34⁺ HSPC²⁸）中，编辑导致细胞周期进程增加，提示出现了类似于在人HSC中观察到的分化表型。此外，在MOLM13、OCI-AML4和MUTZ-3细胞中，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后，单细胞来源的集落生长减少（图7C和图7D），显示了HOTSCRAMBL干扰如何在遗传和表型多样的一系列依赖HOXA的AML细胞系中损害集落形成潜力。

侵袭性AML的一个标志是在异质性细胞群中维持更原始、未分化的群体。他们进行了免疫分型以了解 HOTSCRAMBL编辑如何改变AML细胞系中的细胞组成。在HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑后，K562细胞未显示表型群体组成的变化。相比之下，HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑增加了MOLM13细胞中成熟、分化的CD11b⁺CD14⁺和CD14ʰⁱᵍʰ髓系群体的比例，以及OCI-AML4细胞中CD11b⁺ 粒系和CD14⁺ 单核系群体的比例。此外，在MUTZ-3细胞中，它与CD34⁺ 祖细胞样群体减少和分化的CD33⁺ 髓系群体增加相关。

为了进一步验证这些发现，他们检查了从患者来源异种移植物中获得的原代AML细胞中HOTSCRAMBL干扰的影响。在两个患者样本中，HOTSCRAMBLKO和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 的编辑效率相当（图7E）。流式细胞术分析显示，尽管对照组维持了基线分化，但HOTSCRAMBLKO（尤其是HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹）均导致分化的CD11b⁺CD14⁺ 髓系群体增加（图7F和图7G）。在集落形成试验中，与对照组相比，HOTSCRAMBLKO和HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 细胞在初次铺板时表现出总集落数增加（图7H）。然而，在二次铺板时，集落数显著下降，表明自我更新的祖细胞群被耗尽（图7I）。这些数据表明，HOTSCRAMBL不仅在健康人HSC中调节HOXA基因表达，而且在那些利用许多同源异形基因程序来实现干细胞样自我更新特性的白血病中也是必需的。

讨论

HOXA基因是正常HSC自我更新的关键调节因子，并且经常失调以驱动侵袭性髓系恶性肿瘤，包括高危AML。尽管它们在人类疾病中的重要性已得到证实，但目前关于HOXA位点调控的大部分认知都是来自对模式生物的研究推断。HOXA位点中的几个lncRNA已被证明在健康和疾病中发挥作用。HOTAIR 已被证明可以重编程染色质状态以促进转移性乳腺癌。HOXA-AS2 能够实现HBV环状DNA转录的表观遗传抑制。HOXA-AS3 及其旁系同源物 HOXB-AS3 是HOXA簇中心的两个保守lncRNA，在早期发育过程中以顺式作用调节邻近的HOX基因。HOXA10-AS已被鉴定为胶质瘤中的致癌lncRNA，调节关键的发育和癌症相关通路。利用天然存在的人类遗传变异提供的独特视角，他们在此功能性地表征了一个以前未被研究的lncRNA，他们将其命名为 HOTSCRAMBL。他们证明，HOTSCRAMBL对于与SRSF2和其他剪接因子协同实现HOXA基因的有效剪接和表达至关重要，这会改变HSC的自我更新，并可能影响其他体型模式表型。

有趣的是，HOTSCRAMBLrs17437411变异产生的表型效应比完全删除该lncRNA更强，表明可能存在显性失活机制。该变异引入的结构改变似乎改变了RNA构象并损害了SRSF2结合，使突变型转录本能够竞争或隔离必需的剪接或转录因子。他们的DMS-MaPseq数据显示HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 采纳了一种遮蔽SRSF2结合界面的替代结构，这支持了上述解释。然而，他们不能排除潜在的功能获得或新形态成分，因为改变的RNA结构也可能产生新的相互作用或稳定野生型lncRNA不形成的非经典RNP复合物。剪接因子SRSF2的突变，特别是P95H突变，以序列特异性的方式改变外显子识别，驱动关键造血调节因子的反复错误剪接，导致造血功能受损和骨髓发育不良。这些突变可能影响SRSF2的功能方式，导致异常剪接并促进血癌的发展。他们证明 HOTSCRAMBL协调剪接因子SRSF2向HOXA基因（如HOXA9）的有效招募。HOTSCRAMBL活性是否以及如何与SRSF2致癌突变相关联，仍然是未来研究的重要领域。此外，单独干扰HOXA6或HOXA7会导致LT-HSC维持轻微降低，表明rs17437411变异可能通过影响剪接或表达而影响除HOXA9之外的多个HOXA基因。HOXA基因的协同下调支持了HOTSCRAMBL具有更广泛的顺式调控作用，类似于其他与HOXA相关的lncRNA，如HOTTIP和HOTAIRM1。

尽管此类lncRNA通常仅在特定细胞类型中以低水平检测到，但他们的研究展示了人类遗传变异在优先确定其功能方面的价值，并显示了HSC富集的表达如何使HOTSCRAMBL至少在造血区室内具有强效且细胞类型特异性的功能。此外，鉴于此类反义转录本在全基因组范围内普遍存在注释，lncRNA介导的剪接调控可能成为其他基因位点一个重要的调控层面。

他们的研究揭示了HOTSCRAMBL 是人HSC功能的调节因子。易患嵌合体LOY和其他克隆性疾病的遗传变异已被证明会显著增加患血癌的风险，突显了遗传变异在调节HSC动态以促进癌前和恶性状态中的相关性。rs17437411变异与UK Biobank中的一系列表型相关，包括LOY风险降低、发生骨髓增殖性肿瘤及相关疾病的风险降低、多种血细胞计数的轻微减少以及白细胞端粒长度缩短。所有这些表型都与HSC自我更新减少一致，这会限制HSC区室中发生克隆扩增的机会。此外，他们通过实验证明 HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 编辑或KO可以抑制人AML细胞。鉴于HOTSCRAMBLʳˢ¹⁷⁴³⁷⁴¹¹ 抑制AML生长并促进分化，它可能代表了一种血癌复原力变异，类似于最近在MSI2 增强子中鉴定出的一个独特的变异。

从更广泛的角度来看，他们的研究受表型相关遗传变异发现的推动，说明了尽管已知HOX基因调控在进化上高度保守，但改变HOX基因表达的调控策略很可能是在较近的进化过程中被采纳以微调这一过程的，例如他们表征的由 HOTSCRAMBL介导的复杂剪接和表达调控。

这项研究的局限性

他们的研究因HOTSCRAMBL 中的rs17437411变异而集中在造血表型上。然而，考虑到其他相关的表型，该lncRNA很可能也在其他背景下（如骨骼发育）调节HOXA基因的表达。基于他们在此的观察进行的进一步研究可能会扩展他们对这种跨组织精细调控的认识。此外，尽管他们阐明了由自然发生的遗传变异引起的HSC自我更新变化导致的造血可塑性程度，但这种可塑性在个体骨髓中得到补偿的程度（例如通过祖细胞扩增）仍有待通过检查体内人类造血表型来研究。最后，他们专注于SRSF2在协同 HOTSCRAMBL介导剪接表型中的作用，但很可能其他剪接调节因子（如hnRNP）也参与其中。在原代HSPC中进行更深层次、低投入量的机制验证将非常有价值。这是未来研究的一个重要领域。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Peng Lyu et al, Genetic variation reveals a homeotic long noncoding RNA that modulates human hematopoietic stem cells, Cell (2026). DOI: 10.1016/j.cell.2026.04.014.